由于基因表达和调控的复杂性和多样性，客户获得小鼠模型后，在大量扩繁前，应先对模型中目的基因的敲除/表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。

检测结果确认后，再进行大量的扩繁及表型实验等。

BAC（Bacterial Artificial Chromsomes,细菌人工染色体）转基因技术的优点是,携带的基因组片段大小为100-200kb，可以保留完整的基因及基因的调控区域，可以更加真实的模拟体内基因的表达情况。

在以下情况下可选择该技术方案：

①　无法设计原位敲入方案

②　基因的调控区域未知

③　无法确认启动子的组织特异性或者细胞特异性，或无可用的启动子

④　需要表达基因很长，需表达基因的多个转录本或是全部家族基因时

⑤　可与KO配合使用，实现基因的人源化/其他动物源化（通过引入BAC上的调控序列模拟来源动物目的基因的表达调控）

对于普通的转基因，表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子，如CAG、EF1α、CMV等将得到全身表达的转基因小鼠；如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子，将得到组织特异性表达的转基因小鼠，如在AP2的promoter启动下进行表达，会得到脂肪组织特异表达的转基因小鼠。需要特别说明的是，转基因的策略是将转基因片段直接注射到小鼠的受精卵中，转基因片段将会在小鼠基因组中进行随机插入，因为是完全随机的，有可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达，也有可能插入到一些增强区导致转入的基因高表达，通常会出现在小鼠基因组中多拷贝插入的现象。通过原核注射的方法得到的第 一代转基因小鼠称为 founder（首建鼠），由于上述随机性，每一只founder都是不一样的，以每一只founder起源构建得到的可稳定遗传的品系称为line，不同的line之间的表达由于实际插入位点的不同和/或插入拷贝数的不同会有差异。首建鼠与首建鼠之间不应该相互交配。

若目标基因是生殖发育相关的重要基因，则全身敲除该基因后可能会导致阳性鼠死亡或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能，可采用条件性敲除的设计方案。

如果基因有过表达致死或影响生殖的情况，则过表达模型（转基因或者安全位点敲入等）可能会发生表型，导致无法获得阳性小鼠，或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能，可采用诱导表达的设计方案。

显性负效突变(Dominant negative mutation)类模型，杂合子小鼠便会出现表型，如果表型严重到影响到鼠生殖和发育的，可能无法获得阳性小鼠，或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能，可采用诱导表达突变的设计方案。

插入在N端还是C端要结合蛋白的结构域和蛋白的定位情况来综合考虑。插入位置尽量要避开蛋白重要的结构域，如果N端有分泌信号肽，可选择插入在基因的C端，但若实在需要插入在N端，可插入到信号肽的后面，但需要考虑插入外源序列后对信号肽切割效率的影响，此时可用 SignalP (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 或类似的信号肽预测软件进行事先预测评估。

我们在设计转基因或敲入小鼠模型的时候，如果表达的目标基因跟小鼠内源基因相同，或目前市面上没有较好的抗体来检测目的蛋白的表达时，可在设计载体时加入Tag。有多种标签可选择用于标记目的蛋白，常用的小标签有HA、Flag、Myc、His等，可用于蛋白检测、免疫沉淀等生化应用；常用的荧光蛋白有GFP、RFP、mCherry 、tdTomato等，可用于蛋白定位（包括亚细胞定位）和活细胞成像等（需要注意，通过2A肽段编码序列或IRES间隔的荧光蛋白不与目的基因表达产物形成融合蛋白，因此不能起到标签的效果，不能反应蛋白的亚细胞定位或作为标签使用，仅能标示目的基因的时序性和组织特异性表达）。需要注意的是，Tag加入后可能会对基因的表达或蛋白的功能产生无法预期的影响，一般来说蛋白标签分子越大，影响可能会越大。

F0代或嵌合体小鼠中的修饰基因非稳定可遗传，可能生殖系细胞并未被进行编辑因而无法遗传获得阳性后代；可能在一只鼠身上存在多种不同的编辑类型，导致传代后的小鼠基因型不正确或存在多种不同的基因型；每只F0代鼠的情况均不同。为了得到稳定可遗传的基因编辑小鼠，需要将F0代或嵌合体与野生型背景小鼠回交，得到阳性F1代杂合子。转基因品系由于存在多位点多拷贝随机插入的情况，F0代founder鼠可能需要回交多代才能实现稳定。

在各类项目的载体构建的阶段，每一步都需经过PCRà酶切à测序的过程，确保载体的正确性。

在小鼠阶段，采用对5-7天的小鼠进行剪尾鉴定，同样是经过PCR测序的检测过程, 保证KO/CKO/KI模型正确中靶，并且中靶序列正确。KI类模型还有严格的拷贝数检测，确保除了正确中靶的序列外，无额外的随机插入片段。

我们最终会为客户提供至少3只经过鉴定为阳性的杂合子小鼠（转基因为至少3只founder小鼠）。在项目完成得到足够数量的杂合子小鼠后，我们会将该项目的项目完成报告、小鼠使用手册、鉴定体系说明一并发送给客户。